用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行**敏感度的測(cè)定，以便準(zhǔn)確有效的利用**進(jìn)行**。但由于藥敏試驗(yàn)要求比較嚴(yán)格，條件比較高，僅僅在大中專院校或科研單位有條件的可以操作，一些養(yǎng)殖廠或一些門(mén)診難有條件進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物疫病診療中心經(jīng)過(guò)幾年的總結(jié)和實(shí)踐，逐漸總結(jié)出幾套適合基層進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作方法。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的方法主要有紙片擴(kuò)散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），***濃度梯度法（E-test法），和自動(dòng)化儀器等。
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簡(jiǎn)介：
體外****敏感性試驗(yàn)簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST），是指在體外測(cè)定**抑菌或**能力的試驗(yàn)。
根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)近期推薦的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)非苛氧菌（腸桿菌科**、銅綠假單胞菌、和其他非腸科桿菌、葡萄球菌屬**、腸球菌屬**）和苛氧菌（嗜血桿菌屬**、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌和其他鏈球菌）選擇常規(guī)藥敏試驗(yàn)的優(yōu)選**（A 組***）或臨床使用的主要***（B組***）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。
**藥對(duì)**性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過(guò)程中不科學(xué)的、盲目的濫用**藥，很多致病性**產(chǎn)生了耐藥性，使得**藥對(duì)**性**的控制效果越來(lái)越差，不但造成**浪費(fèi)，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，**藥的防治效果越來(lái)越差。并且各種致病菌對(duì)不同的****的敏感性不同，同一**的不同菌株對(duì)不同****的敏感性也有差異。長(zhǎng)期以來(lái)，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用****往往失去藥效，以及不能很好的掌握**對(duì)**的敏感度，所以一個(gè)正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用****的參考，并提高療效。農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物疫病診療中心總結(jié)出幾套適合基層進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作方法，現(xiàn)簡(jiǎn)單介紹如下。
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分類：
紙片擴(kuò)散法
該法是將含有定量****的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的**在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，****的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周?chē)纬蓾舛忍荻取Ｍ瑫r(shí)，紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)的菌株不能生長(zhǎng)，而抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)，從而在紙片的周?chē)纬赏该鞯囊志Γ煌囊志?*的抑菌圈直徑因受**在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)**的敏感程度，并與該**對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。
稀釋法
稀釋法藥敏試驗(yàn)可用于定量測(cè)試****對(duì)某一**的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實(shí)驗(yàn)時(shí)，****的濃度通常經(jīng)過(guò)倍比（lg2）稀釋，能抑制待測(cè)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的*低**濃度成為*小抑菌濃度（MIC），一個(gè)特定****的測(cè)試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測(cè)**的解釋性折點(diǎn)（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時(shí)也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC.
2.1 瓊脂稀釋法 首先制備含****的瓊脂稀釋平板。再接種待測(cè)菌株，然后是結(jié)果判讀。
2.2 肉湯稀釋法
***濃度梯度法
自動(dòng)化儀器法
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實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)材料
普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：可去生化試劑店購(gòu)買(mǎi)，做不同**的藥敏試驗(yàn)可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)可選擇普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基。做沙門(mén)氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。
藥敏試紙：購(gòu)買(mǎi)或自制（詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備）
**：待做藥敏試驗(yàn)的**
儀器：接種環(huán)、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
2.1 藥敏片的準(zhǔn)備：購(gòu)買(mǎi)或自制
2.1.1 制備方法：取新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓**后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。
2.1.2 **藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jī)?nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄**名稱，放37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月。
2.2 藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按商品藥的使用**量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說(shuō)明量**量0.01%飲水，可按這個(gè)比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。
實(shí)驗(yàn)操作方法
3.1 藥敏片法
3.1.1 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰**的接種環(huán)挑取適量**培養(yǎng)物，以劃線方式將**涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用**接種環(huán)取適量**分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到**點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至**均勻密布于平皿。（另：可挑取待試**于少量生理鹽水中制成**混懸液，用**棉拭子將待檢**混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻。）
3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰**后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。
3.1.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
3.2 牛津杯法
3.2.1 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰**的接種環(huán)挑取適量**培養(yǎng)物，以劃線方式將**涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用**接種環(huán)取適量**分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到**點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至**均勻密布于平皿。（另：可挑取待試**于少量生理鹽水中制成**混懸液，用**棉拭子將待檢**混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.2.2 以無(wú)菌操作將**的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，并在小管處標(biāo)記各種**名稱。每個(gè)平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察結(jié)果。
3.2.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
3.3 打孔法：
該法較簡(jiǎn)單，成本低，易操作，比較適用于商品**的檢測(cè)。
3.3.1 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰**的接種環(huán)挑取適量**培養(yǎng)物，以劃線方式將**涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用**接種環(huán)取適量**分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到**點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至**均勻密布于平皿。（另：可挑取待試**于少量生理鹽水中制成**混懸液，用**棉拭子將待檢**混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.3.2 以無(wú)菌操作將**的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。
3.3.3 加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
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結(jié)果觀察
在涂有**的瓊脂平板上，****在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周?chē)欢ň嚯x內(nèi)的**生長(zhǎng)受到抑制。過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與**濃度、劃線**濃度有直接關(guān)系。
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判定標(biāo)準(zhǔn)
一、藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。
表1 **敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)
| 抑菌圈直徑（毫米） | 敏感度 |
| 20以上 | 極敏 |
| 15~20 | 高敏 |
| 10~14 | 中敏 |
| 10以下 | 低敏 |
| 0 | 不敏 |
具體對(duì)于不同的菌株，及不同的***紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。
二、**敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏。
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影響因素
培養(yǎng)基
**藥敏試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基種類較多，多數(shù)情況下，采用WHO組織統(tǒng)一要求的M—H培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類**競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，因此進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)效果較好。此外，還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到觸媒的作用。但是，有些**對(duì)培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培養(yǎng)基才能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。例如，流感嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用HTM瓊脂；淋球菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用加5%羊血的巧克力M—H瓊脂；肺炎鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)用M—H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到溶酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環(huán)素對(duì)銅綠假單胞菌的試驗(yàn)結(jié)果，含量過(guò)高，抑菌圈會(huì)變小，含量過(guò)低，抑菌圈會(huì)大得不可接受。
**藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基厚度大約為4mm，若培養(yǎng)基厚度大于4mm，會(huì)使**出現(xiàn)耐藥；若小于4mm，本應(yīng)耐藥的易出現(xiàn)敏感。所以，試驗(yàn)時(shí)一定不要把藥敏紙片放在中央部位，而應(yīng)均勻地排布在平皿周?chē)呐囵B(yǎng)基上。制作藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基用水，主要是Ca、Mg、A1等礦物質(zhì)離子，也在很大程度上影響著藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。
試紙片
試紙片材質(zhì)的好壞，對(duì)**穩(wěn)定性和活性有很大影響。加工藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，雜質(zhì)少，對(duì)**保存無(wú)太大影響。然而，臨床中很多用的是普通紙，被水浸潤(rùn)后會(huì)呈堿性，并且含有大量無(wú)機(jī)離子，因此使用普通紙加工的試紙片**有較大的影響。藥敏紙片的pH值一般要求為中性，這樣才適合藥的活度。藥敏紙片的厚度要求大約1mm，這樣才有利于**的生長(zhǎng)和**的擴(kuò)散速度。藥敏紙片的直徑在6．00～6．35mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會(huì)影響藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。
含藥紙片的片間差和質(zhì)量好壞是做藥敏試驗(yàn)的關(guān)鍵。一些藥敏紙片買(mǎi)來(lái)時(shí)就有抑菌環(huán)偏大或偏小的問(wèn)題，紙片之間又存在很大的片間差。因此，紙片在用前必須檢驗(yàn)其片間差和準(zhǔn)確度，只有都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求后才能使用。同時(shí)要注意紙片的保存，因?yàn)橛械募埰缜嗝顾仡悾诒４嬷幸驗(yàn)槭艹睗癍h(huán)境的影響容易降低其**的活性。因此，紙片應(yīng)放低溫下(-10℃)保存，同時(shí)要避免潮濕，以保持****的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應(yīng)在室溫平衡至少10min后再打開(kāi)，避免冷凝水影響藥效。
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由于各種菌對(duì)**的敏感性不同，產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小不同，如果菌種不純，試驗(yàn)中所產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小與該菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小存在較大的差異，影響判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此需要對(duì)各種致病菌提純后，分別進(jìn)行不同的藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)時(shí)，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標(biāo)準(zhǔn)是要求菌液濃度在1．5億/ml 左右。若菌液濃度過(guò)高，該菌會(huì)對(duì)所有**產(chǎn)生耐藥；反之，菌液濃度過(guò)低，該菌會(huì)對(duì)所有**均敏感。***的方法是使用分光光度計(jì)測(cè)定新鮮培養(yǎng)物菌懸液的吸光度，來(lái)確定菌液濃度。國(guó)家**耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)的三級(jí)甲等醫(yī)院，其微生物實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)用此法來(lái)確定藥敏試驗(yàn)的菌液濃度。
藥敏試驗(yàn)中要將菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上，使**均勻分布，這樣才能使試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)較大的偏差。涂菌后15min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，**要有一段時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程，但是時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)使**產(chǎn)生耐藥。貼藥敏紙片時(shí)，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準(zhǔn)確性。**殺滅**存在一定的量比，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基上**層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根據(jù)一種**抑菌圈的有無(wú)或者大小，只能判斷出該藥對(duì)**有沒(méi)有效果，但其敏感性的高低需要通過(guò)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來(lái)確定。**的敏感程度需要根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，并結(jié)合以上因素做綜合分析，才能得出科學(xué)的結(jié)論，而片面地根據(jù)藥敏圈的大小來(lái)決定敏感與否，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。
[1] 培養(yǎng)時(shí)間
一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃ 8-18小時(shí)，有些**藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好**藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時(shí)，使**藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲**的生長(zhǎng)，而得到較大的抑菌圈。
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應(yīng)用
**敏感實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)選擇高敏**進(jìn)行**，也可選用兩種**協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏**時(shí)應(yīng)考慮**的吸收途徑，因?yàn)槲覀兯幟魧?shí)驗(yàn)是藥液直接和**接觸，而在給禽用藥的時(shí)候，必須通過(guò)機(jī)體的吸收才能使**達(dá)到一定的效果，所以在給禽用藥時(shí)，高敏**一定要配合適宜的給**法，這樣才會(huì)達(dá)到好的**效果。
__參考資料:
1． 淺談**藥敏試驗(yàn)的影響因素 ．檢驗(yàn)世界網(wǎng) [引用日期2013-01-25] ．